|
3. Методи вивчення клітин Цитологія використовує методи дослідження, що базуються на досягненнях фізики, хімії, біохімії, молекулярної біології і спрямовані на вивчення структури, функцій та хімізму клітин. Проте основними методами залишаються мікроскопічні й, особливо, електронномікроскопічні, які дають можливість виявляти деталі будови клітин на різних рівнях (від клітинного до макромолекулярного).
Розміри об’єктів та їх деталей, невидимих для неозброєного ока, вивчаються з використанням цитологічних методів. Для визначення розмірів використовують зазвичай мікрометри (мкм, або µm), а також нанометри (нм, або nm). Раніше широко використовувалась одиниця Ангстрем (Å), що дорівнює 10–1 нм, зараз вона використовується рідко.
Співвідношення лінійних одиниць виміру, які найчастіше використовуються в цитології:
1 міліметр (1 мм) = 10–3 м = 103 мкм = 106 нм = 107 Å;
1 мікрометр (1 мкм) = 10–6 м = 10–3 мм = 103 нм = 104 Å;
1 нанометр (1 нм) = 10–9 м = 10–6 мм = 10–3 мкм = 10 Å;
1 ангстрем (1 Å) = 10–10 м = 10–7 мм = 10–4 мкм = 10–1 нм. а) методика виготовлення цитологічних препаратів
Потрібно відзначити, що не зважаючи на значні успіхи сучасної цитології, мікроскопічне дослідження цитологічних препаратів залишається продуктивним не лише для студентів під час вивчення мікроморфології організму, але й у наукових дослідженнях. Для успішного вивчення цитологічних препаратів важливим є знання методики їх підготовки. Необхідною умовою отримання якісного препарату є виготовлення з тканини чи групи клітин тонкого зрізу, його зафарбовування з метою підвищення контрастності. Крім того, потрібно забезпечити збереження препарату, тобто належно його зафіксувати. З навчальною метою використовують як тимчасові, так і постійні препарати. Тимчасовими користуються одноразово, тоді як постійні можуть служити багато років.
Тимчасові цитологічні препарати мають ту перевагу, що їх легше і простіше виготовити. На них можна спостерігати живі клітини і тканини. Важливим критерієм якості тимчасового препарату є проходження через нього світла, що забезпечується вичлененням тонкої прозорої пластинки з клітини чи тканини. Такі препарати виготовляють у вигляді мазків (наприклад, мазок крові), плівок (наприклад, плівка цибулі) чи розтягнутої пластинки пухкої тканини. Підготовлений належним чином об'єкт підфарбовують 0,1% розчином метиленової синьки або іншим барвником (нейтральним червоним, трипановим синім). Після забарвлення препарат накривають накривним скельцем, тепер він готовий для вивчення під мікроскопом.
Для вивчення рослинних клітин використовують давлені препарати. Давлені препарати необхідні для вивчення мітозу, каріотипів, хромосомних порушень у корінцях і конусах наростання стебел, мейозу у молодих пиляках. Найчастіше для виготовлення давлених препаратів використовують фіксатори Карнуа (6:3:1), Нюкомера (6:3:1:1:1), Баталя (5:5:1:1), оцтовий алкоголь (3:1), льодяну оцтову кислоту та ін. При виготовленні давлених препаратів виключне значення мають способи мацерації тканин до забарвлення. Звично для цього використовують 45%-ний розчин оцтової кислоти (для твердих об’єктів її підігрівають), 40-45%-й – пропіонової кислоти, 1 н. розчин соляної кислоти, різні ензими (пектиназа, цитаза) та ін. Забарвлюють препарати ацетокарміном, ацетоорсеїном, пропіоновим гематоксиліном та ін.
Постійні цитологічні препарати виготовляють за певною схемою, яка передбачає фіксацію матеріалу та його зневоднення для попередження розкладання вихідної тканини. Для виготовлення постійних цитологічних препаратів застосовують спеціальну методику, яка включає ряд етапів.
Після взяття матеріалу (шматочка тканини завтовшки від 1 мм до 10 мм) його фіксують, щоб запобігти розкладанню. Для цього використовують 5–20%-ий розчин формаліну або різні спирти чи складні суміші. Для виготовлення тонких зрізів (завтовшки від 5 мкм до 30 мкм) матеріал попередньо ущільнюють шляхом заморожування або просочування речовинами, які, ущільнюючись самі, роблять тканину придатною для різання.
Ріжуть на спеціальному апараті — мікротомі, який дає можливість отримати тонкі зрізи. Потім зрізи фарбують і заключають між двома скельцями в спеціальне середовище, в якому вони зберігаються.
Слід відзначити, що через слабку контрастність структур нативні гістологічні препарати складно досліджувати, тому для успішного їх вивчення необхідно підвищити контрастність структур. Для цього служить методика фарбування об’єктів гістологічними барвниками, які елективно (вибірково) забарвлюють лише певні утвори, наприклад, ядра, еластичні мембрани, глікоген, ліпіди. Залежно від того, які фарби сприймає структура, її називають базофільною (якщо вона фарбується основними барвниками) чи оксифільною (при забарвлені кислими фарбами). Метахромазія — це явище, коли певний утвір фарбується не в колір фарби, а в якийсь інший, тобто, коли між хімічними речовинами клітини і фарбою утворюються сполуки, що мають особливе забарвлення, не схоже на застосовану фарбу.
Класифікація цитологічних (гістологічних) фарб базується на вибірковості забарвлення тих чи інших структур. Розрізняють декілька видів фарб.
Ядерні (оснóвні) фарби: гематоксилін — фарбує ядра в фіолетовий колір; сафранін — в яскраво-червоний; кармін — у червоний.
Цитоплазматичні (кислі, фонові) фарби: еозин — забарвлює цитоплазму в рожевий колір, пікринова кислота — у жовтий, фуксин кислий — у червоний.
Спеціальні фарби: орсеїн забарвлює еластичні елементи (волокна і мембрани) у вишнево-коричневий колір; судан І, ІІ, ІІІ, ІV — фарбує жири в оранжевий або коричневий колір (судан чорний В — у чорний); кармін за методикою Беста забарвлює глікоген у червоний колір.
Метод імпрегнації — це просочування тканин солями металів з наступним осадженням їх у вигляді дрібних металевих пилинок. Використовується для виявлення нервової тканини і клітинних границь.
Виготовлені таким чином препарати заключають у середовище (частіше в канадський бальзам) між двома скельцями (предметним і накривним), після чого вони стають придатними для вивчення під світловим мікроскопом.
Важливий момент при виготовленні препаратів для трансмісійного електронного мікроскопа — вибір фіксаторів. Основним фіксатором є чотириокис осмію за умови попередньої фіксації в глутаральдегіді. Зневоднюють об’єкт у спиртах зростаючої міцності і заливають епоксидними смолами, які полімеризуються і тверднуть. Залитий об'єкт ріжуть на ультрамікротомі, який дає можливість отримувати зрізи завтовшки 40–80 нм; такі зрізи називають ультратонкими.
У процесі підготовки об'єкта для дослідження під мікроскопом можуть виникати штучні утвори, які стають причиною отримання хибних результатів. Такі штучні утвори мають назву артефакти. Прикладом простих артефактів є пухирці повітря, які потрапляють під накривне скельце. Це також може бути осад фарби, волокна тканини, якою протирають скельця. Більш складні артефакти — це зміни форми клітини, виникнення щілин унаслідок надмірного ущільнення тканин при фіксації чи зневодненні матеріалу тощо. б) світлова мікроскопія
Дрібні біологічні об’єкти (клітини, тканини) вивчаються шляхом мікроскопування протягом більш як 300 років. 3 моменту використання перших мікроскопів для дослідницьких цілей вони постійно вдосконалювалися.
Сучасні світлові мікроскопи — це складні оптичні системи. Для вивчення гістологічних препаратів найчастіше застосовують стандартні світлові мікроскопи, які дають можливість отримувати збільшення у 2500–3000 разів (добуток збільшення об’єктива на збільшення окуляра). Роздільна здатність такого мікроскопа (розмір найменшої структури, яку можна побачити у мікроскопі) дорівнює приблизно 0,2 мкм. Роздільна відстань (здатність) залежить від довжини світлової хвилі: чим коротша світлова хвиля, тим менша роздільна здатність мікроскопа, тобто відстань, при якій деталі розрізняються як окремі. Роздільна відстань визначається за формулою do=1/2l, де do — роздільна відстань, l — довжина світлової хвилі. Отже для звичайного світлового мікроскопа (при довжині світлової хвилі 0,4 мкм) роздільна здатність дорівнює: do= 1/2×0,4 мкм = 0,2 мкм.
Крім звичайного світлового мікроскопа, який залишається основним інструментом при вивченні клітин і тканин, для спеціальних цілей використовують фазовоконтрастний, інтерференційний, поляризаційний та інші мікроскопи.
У фазовоконтрастному мікроскопі використовується явище дифракції. За допомогою кільцевої діафрагми “фазової пластинки” підвищується контрастність об’єкта, що дає можливість розрізняти структури, які мають різні показники заломлення. Застосовується такий мікроскоп для вивчення живих об’єктів без їх фіксації та фарбування.
Інтерференційний мікроскоп характерний тим, що в ньому один пучок світла розділяється на два, які потім накладаються й інтерферують. Структури, різні за товщиною і показниками заломлення, у такому мікроскопі стають контрастними і добре видними. Інтерференційний мікроскоп дозволяє визначати товщину об’єкту і вміст у ньому сухої маси речовини.
В основі методу поляризаційної мікроскопії лежить здатність різних компонентів клітини заломлювати поляризоване світло, що дає можливість виявляти поодиноке і подвійне заломлення світлових променів. Використовується при вивченні міофібрил, колагенових волокон тощо.
У темнопільному мікроскопі світло падає скісно і тут використовується ефект Тиндаля, коли структури стають видними завдяки їх різкому свіченню на темному фоні. Метод може застосовуватися для вивчення живих клітин.
Флуоресцентна (люмінісцентна) мікроскопія використовує явище флуоресценції, свічення об'єкта, збуджене ультрафіолетовими променями. Розрізняють первинну, власну флуоресценцію (хлорофіл флуоризує яскраво-червоним кольором), і вторинну, або наведену, що збуджується флуорохромами (акридин оранжевий збуджує свічення ДНК яскраво-зеленим, а РНК — червоно-оранжевим світлом). Використовується також при імуногістохімічних дослідженнях.
Ультрафіолетова мікроскопія ґрунтується на принципі використання явища вибіркового поглинання ультрафіолетових променів речовинами. Різні речовини мають різні спектри поглинання цих променів, що дає можливість виявляти певні сполуки, наприклад, диференціювати ДНК і РНК. в) електронна мікроскопія
Електронний мікроскоп, сконструйований у 1931 р. Еметом Руска, дозволив зробити крок уперед у техніці мікроскопування. У ньому використовується як джерело світла потік електронів, який має значно коротшу довжину хвилі, ніж світловий мікроскоп. Спрямовують пучки електронів магнітні, електростатичні чи електромагнітні лінзи (рис. 1.10). Досягнення в техніці виготовлення ультратонких зрізів дало можливість отримати збільшення у 1 млн разів. Роздільна здатність просвічувального (трансмісійного) електронного мікроскопа наближається до 0,1 нм, а для біологічних об’єктів практично складає 2 нм.
Розширення електронномікроскопічних досліджень йде в напрямку конструювання певних різновидів електронного мікроскопа, таких як сканерний, або растровий, який дає тривимірне (об’ємне) зображення об'єкта. Він забезпечує велику глибину різкості (у 100–1000 разів більшу, ніж у світловому мікроскопі), значно більше збільшення (у десятки тисяч разів) і високу роздільну здатність.
Комп’ютерна інтерференційна мікроскопія дає можливість отримувати висококонтрастні зображення при спостереженні субклітинних структур. Лазерна конфокальна мікроскопія забезпечує чітке бачення в фокусі по всьому полі. У поєднанні з комп’ютерною технікою можна отримати просторову реконструкцію досліджуваного об’єкта. Для вирішення спеціальних завдань застосовують позитронну емісійну томографію, рентгенівську мікроскопію (дає можливість спостерігати об’єкти не у вакуумі, а за звичайних умов). Крім цього, в електронній мікроскопії застосовують методи розламів, напилення металами, електронномікроскопічної цитохімії тощо. г) методи вивчення хімізму клітин
В останній час з метою вивчення хімічної структури клітин та їх компонентів використовується цілий ряд нових методів досліджень. Поширення набули методики виявлення хімічних речовин і ферментів на зрізах клітин чи тканин у місцях їх розміщення (in situ — на місці), до яких належать цитохімічні та гістохімічні методи.
Цито- і гістохімічні методи дають можливість виявляти локалізацію в клітині різних хімічних речовин, а також активність деяких ферментів (гістоензимологічні дослідження). Шляхом ряду перетворень на місці досліджуваних речовин виявляється забарвлений осад, за станом якого роблять висновок про відносну кількість речовин і активність ферментів. Ці методи служать для виявлення нуклеїнових кислот, білків, глікогену та ферментів: фосфатаз, дегідрогеназ та інших.
Крім цито- і гістохімічних методів, використовуються ще імуногістохімічні методи, в яких використовується реакція антиген-антитіло. Шляхом імунізації можна отримати відповідні антигенам антитіла, які потім зв'язують з флуорохромами або ферментами. Після обробки гістологічних препаратів у місцях локалізації антигенів знаходяться молекули мічених антитіл. Останні виявляють або шляхом люмінесценції (свічення) або за наявністю відкладених продуктів гістохімічних реакцій. Методи використовуються для ідентифікації клітин чи речовин, наприклад, гормонів.
Радіоавтографічний (авторадіографічний) метод полягає у використанні радіоактивних ізотопів для мічення певних сполук, в які ці ізотопи включаються. На цитологічних зрізах мічені сполуки чорнять фотоемульсію і по засвічених ділянках — треках — визначають локалізацію цих сполук. Метод використовується для виявлення нуклеїнових кислот, йоду в щитовидній залозі і т.п. Застосування методу авторадіографії на електронномікроскопічному рівні дає можливість виявляти речовини, характерні для тих чи інших органел і тим самим визначати їх участь у метаболізмі цих сполук.
Існує ряд кількісних оцінок клітинних структур.
Морфометричні методи — сукупність прийомів, які дають можливість кількісної оцінки параметрів клітинних структур (діаметру, товщини, кількості об’єктів на площі перетину тощо).
Стереологічні методи дозволяють шляхом спеціальних прийомів і розрахунків визначити тривимірні параметри об’єктів (наприклад, їх відносний об’єм, вміст в одиниці об’єму тощо), оцінюючи на зрізах їх лінійні і площинні виміри.
Існують напівавтоматичні та автоматичні методи аналізу зображень, які за допомогою комп’ютерів дають можливість швидко кількісно оцінити багато ознак на препараті та за їх сукупністю ідентифікувати ті чи інші структури (наприклад, типи клітин за розміщенням хроматид в ядрах).
Цитофотометрія (спектрофотометрія) — метод кількісного визначення вмісту різних речовин у клітині на основі вивчення спектрів поглинання ними світлових променів. За допомогою приладу цитофлуорографа, у якому використовується лазерний промінь, можна визначити розміри і форму клітин, їх життєдіяльність, розділити в суспензії клітин їх субодиниці.
Диференціальне центрифугування — метод, який дає можливість виділити в достатньо чистому вигляді потрібну кількість органел, необхідних для їх повного біохімічного аналізу. Цей метод полягає в руйнуванні клітини шляхом гомогенізації у відповідному середовищі; часто для цього використовують розчин сахарози. Потім клітинний гомогенат центрифугують. Цей метод називають диференціальним центрифугуванням, оскільки при його використанні внаслідок щоразового збільшення швидкості та тривалості центрифугування, різні органели осідають на дні пробірки шарами: спочатку ядра, відтак мітохондрії та лізосоми, потім комплекс Гольджі, обривки цитоплазматичних мембран (плазмолеми, ендоплазматичної сітки) і, нарешті, при найбільш тривалому центрифугуванні на високих швидкостях в осад випадають рибосоми. Після кожного центрифугування відбирають осад і проводять його біохімічний аналіз.
Існує ще інший, новий метод, фракціонування клітин — центрифугування в градієнті щільності, який полягає у нашаровуванні розчину сахарози зі зростанням її щільності. При центрифугуванні таким чином органели, які є в гомогенаті, розміщуються в центрифужних пробірках на тих самих рівнях, що й розчини сахарози відповідної їм щільності; це дає можливість розділяти органели однакових розмірів за різницею їх щільності.
Вимірювання різними способами звичайно називають морфометрією. Морфометричні методи дають можливість визначати кількість структур, їх площі, діаметри. Розрізняють автоматизовану морфометрію, при якій всі параметри вимірюються і реєструються в приладі автоматично.
Згадані кількісні параметри найбільш ефективно застосовуються для вивчення клітин автоматизованими системами обробки зображень. Ці системи за допомогою комп’ютерів здатні не лише об’єктивізувати спостереження, статистично опрацьовувати одержані дані, а й кількісно моделювати та прогнозувати виявлені процеси у клітинах і тканинах. д) методи дослідження живих клітин
Матеріалом для вище описаних вище методик цитологічних досліджень переважно є клітини, які попередньо умертвляють. Проте значне зацікавлення викликає можливість експериментування над живими клітинами. Тому розроблено методики вивчення певних сторін життєдіяльності клітин, інкубованих у спеціальних живильних середовищах.
Метод тканинних культур. Багато відомостей про клітини дає вирощування їх поза організмом у так званих тканинних культурах на спеціальних живильних середовищах. Тканину звичайно поміщають у скляні посудини, звідси і дослідження отримали назву вивчення in vitro (від лат. іn — в, vitro — скло), хоча тепер частіше культури вирощують у пластмасових посудинах. Виділені з тканин клітини інкубують при температурі +38°С– +39°С (для клітин тваринного і людського організмів) та при +22°С – +28°С (для рослинних клітин) у живильному середовищі відповідного складу. Клітини тоді ростуть у вигляді суспензії або моношару.
Цінність методу культури тканин полягає в тому, що, з одного боку, об’єктом досліджень є клітина як природна модель-одиниця біологічної активності, що наближає умови експерименту до нативних. З іншого боку, з певним ступенем автономності одиниця біологічної активності (клітина, тканина) вилучається з під впливу корелятивних зв’язків і залежностей материнського організму. Створюються умови invitro, які піддаються управлінню та регуляції. Такий метод не забезпечує повних умов життя тканини (відсутні регуляторні впливи організму), проте він дає можливість досліджувати під мікроскопом рух, ріст і поділ клітин, вивчати вплив на клітини різних фізичних та хімічних факторів. Одним із напрямків удосконалення методу культури тканин є вирощування клітинних суспензій. Культура клітин, або суспензійна культура, ‑ це вирощування окремих клітин або невеликих їх груп у завислому стані у рідкому живильному середовищі з використанням апаратури, що забезпечує їх аерацію і перемішування. Характерною особливістю суспензійних культур є їх морфологічна та біохімічна гетерогенність. Клітинна популяція містить клітини, які відрізняються за розміром і формою.
Для дослідження живих рослинних клітин використовують культуру ізольованих протопластів. Ізольовані протопласти можна визначити як “голі” клітини рослин, оскільки клітинна стінка видаляється механічним або ферментативним способом. Система ізольованих протопластів дає можливість вести селекцію на клітинному рівні, працювати у малому об’ємі з великою кількістю індивідуальних клітин, отримувати нові форми рослин шляхом прямого перенесення генів, отримувати соматичні гібриди між віддаленими у систематичному відношенні видами. Оскільки в ізольованих протопластах одразу починається регенерація клітинної оболонки, то вони є зручним об’єктом для вивчення формування целюлозних мікрофібрил. е) мікроманіпуляції над клітинами
Мікроманіпуляції над клітинами, тканинами чи ембріональними зачатками — це методики, що мають на меті втручання в живу клітину чи ембріональний зародок із тим, щоб викликати в них певні зміни і тим самим дослідити поведінку цих утворів у змінених умовах (рис. 1.13). Це може бути “гібридизація” клітин хімічним шляхом (дією чотирихлористого вуглецю) або мікрохірургічне (під мікроскопом) об'єднання двох різних клітин (наприклад, фібробласт курчати і міокардіоцит людини). До мікроманіпуляцій над клітинами належить й експеримент над ембріоном, коли на рівні гаструли пересаджують певну частину ембріона (наприклад, хордомезодерму) в певну ділянку зародка для з’ясування явища ембріональної індукції.
До сучасних мікроманіпуляцій над клітинами відносять соматичну гібридизацію та генну інженерію. Суть соматичної гібридизації полягає у злитті між собою диплоїдних соматичних клітин та їхніх ядер. До факторів, які забезпечують злиття соматичних клітин між собою відносять: інактивний вірус Сендай (вірус парагрипу, що інактивований УФ – випромінюванням), поліетиленгліколь (ПЕГ), лазерного і нейтронного опромінення, а також вплив електричного поля. Завдяки соматичній гібридизації можна здійснити рекомбінацію генетичного матеріалу віддалених у еволюційному відношенні організмів; вдається долати міжвидові й навіть міжродові бар’єри.
Суть генної інженерії полягає у виділенні і штучному створенні функціонально активних генетичних структур (генів, їх блоків, молекул ДНК) з наступним введенням їх в клітину (організм) з метою цілеспрямованої перебудови її генотипу. При цьому введений генетичний матеріал повинен стати складовою частиною генетичної системи реципієнтної клітини (організму), а саме: реплікуватися разом з його ДНК, виконувати регуляторні команди клітини, включатися у процеси транскрипції і трансляції та забезпечувати синтез відповідних продуктів (білків, гормонів) і прояв нових, не властивих для даного організму ознак і властивостей. є) комплексні методи вивчення клітин
Основні методики дослідження клітин показують багатство арсеналу методів у цитології й дають можливість здійснювати точний аналіз, починаючи зі структури клітини до молекулярної композиції окремих їх частин. Однак згаданим методикам властиві певні недоліки. Так, вирощування клітин на штучних середовищах позбавляє їх регуляторного впливу організму. Інші методи дослідження, в яких фіксація та фарбування клітин міняють до певної міри їх прижиттєву структуру, дають ті чи інші похибки. Тому, продовжуючи досліджувати біологію клітини, вивчаючи її будову, хімізм, функції, розвиток, диференціацію та старіння, учені часто застосовують комплексне дослідження тих чи інших явищ у життєдіяльності клітин, вивчення певного питання з різних боків. Таким чином, зводяться до мінімуму недоліки окремих методик дослідження.
Застосування оптичних приладів у поєднанні з комп’ютером забезпечує всебічне дослідження клітини, її хімічного складу, цитофізіології, дає можливість моделювати фізіологічні та біохімічні процеси в клітинах. Інколи дослідження проводяться паралельно в різних лабораторіях різними методиками з тим, щоби отримати дані, які доповнювали б одні одних і в підсумку створювали уявлення про процеси в живих клітинах. Особливого зацікавлення набула генна інженерія — вивчення генотипу рослинного, тваринного та людського організмів, а також можливостей втручання в нього з метою виправлення генетичної патології. Всі опубліковані на сайті матеріали належать їх авторам. Матеріали розміщено виключно для ознайомлення. Копіювання та використання інформації суворо заборонено.
|
